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检测原理

• 原理示意图
  

  图1：检测原理

• 检测流程图
  

  图2：检测流程图

验证数据

• 去滋扰能力

  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro对游离p24的去滋扰能力

  

  图3：有用镌汰游离p24的滋扰
  将差别浓度的p24卵白添加稀释液中，效果显示，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974) 基本不会检测到添加到稀释液中的游离p24卵白。

  

  图4：特异性检测慢病毒颗粒上的p24卵白
  将差别浓度的p24卵白添加到纯化的慢病毒样本中，效果显示，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974)，检测到的p24卵白浓度与现实慢病毒颗粒上p24浓度一致。

• 高准确度和接纳率

  接纳率用于确定剖析物检测是否受样品基质差别的影响，通过将已知量的剖析物加标到差别的样品基质中来验证接纳率。以下是凭证具有代表性的准确度验证天生的报告和数据示例，在这项验证中，使用3批次试剂盒（GenScript, L00938），将已知量的剖析物加标到基质中混淆验证接纳率，样本重复丈量3次。

  Table 1: 三批次试剂盒接纳率测试效果为 86%-108%

  批次编号	重复次数	平均测值（pg/mL）	接纳率
  #1	3	1945.30	86%
  #2	3	1787.64	108%
  #3	3	1752.76	90%

• 高检测细密度

  A. 批内细密度/重复性

  批内细密度验证体现测定板内每孔之间的重复性，有助于确保在测定板的差别孔中运行样本检测可以给出可靠的效果。
  以下是凭证具有代表性的批内细密度验证天生的报告和数据示例，在这项验证中，使用BET9登录网址p24检测试剂盒（GenScript, L00938），划分对低、中、高3个浓度水平的样本举行测试，每个样本各重复检测10次，每个样本盘算10次丈量浓度效果的变异系数(CV)。

  Table 2: 三批次试剂盒批内细密度验证效果

  批次编号	重复次数	平均测值（pg/mL）	%CV
  #1	10	215.55	3%
  #1	10	829.45	4%
  #1	10	1537.42	4%
  #2	10	209.60	5%
  #2	10	792.76	2%
  #2	10	1431.42	3%
  #3	10	188.09	6%
  #3	10	759.99	4%
  #3	10	1377.71	3%

  B. 批间细密度

  批间细密度体现统一样品在多批测定间的重现性，有助于确保在差别批次试剂盒中运行样本检测可以给出可靠的效果。
  以下是凭证具有代表性的批间细密度验证天生的报告和数据示例，在这项验证中，使用3个差别批次试剂盒（GenScript, L00938），划分对低、中、高3个浓度水平的样本举行测试，每个样本各重复检测10次，每个样本盘算30次丈量浓度效果的变异系数(CV)。

  Table 3: 三批次试剂盒批间差验证效果

  批次数目	重复次数	平均测值 pg/mL	%CV
  3	3×10	204.41	7%
  3	3×10	794.07	5%
  3	3×10	1448.85	6%

• 慢病毒纯化生产全流程滴度检测

  使用慢病毒滴度p24试剂盒对慢病毒纯化生产全流程举行慢病毒滴度监测，有利于慢病毒纯化和成产历程控制和优化。BET9登录网址慢病毒滴度p24试剂盒（GenScript, L00938）的超宽线性可以有用减小稀释倍数，从而节约检测时间以及镌汰稀释历程导致的误差。

  Table 4a: BET9登录网址慢病毒滴度p24试剂盒在慢病毒纯化生产全流程的滴度检测

  样品名称	样品OD值	样品检测值 (pg/mL)	稀释倍数	p24浓度 (LP/mL)	CV %
  HM上清液	3.151	2445.918	100	凌驾检测规模，无效	/
  	1.225	444.343	3000	1.67E+10
  PB核酸酶孵育	3.12	2369.055	100	凌驾检测规模，无效	/
  	1.242	451.997	3000	1.69E+10
  Centrifugation离心	3.103	2328.92	100	凌驾检测规模，无效	/
  	0.94	321.172	3000	1.20E+10
  CF-01澄清过滤	3.136	2405.64	100	凌驾检测规模，无效	/
  	0.926	315.765	3000	1.18E+10
  UF/DF浓缩换液	2.183	1040.264	3000	3.90E+10	3
  	0.152	36.234	90000	4.08E+10
  CF-02澄清过滤	1.994	890.168	3000	3.34E+10	6
  	0.142	32.441	90000	3.65E+10
  GF凝胶过滤	1.496	578.496	3000	2.17E+10	/
  	0.106	18.902	90000	凌驾检测规模，无效
  UF/DF-02浓缩换液	2.623	1501.37	3000	5.63E+10	3
  	0.185	47.906	90000	5.39E+10
  最终样	3.155	2459.286	3000	凌驾检测规模，无效	/
  	0.799	265.916	90000	2.99E+11

  Table 4b: 竞品慢病毒滴度p24试剂盒在慢病毒纯化生产全流程的滴度检测

  样品名称	样品OD值	样品检测值 (pg/mL)	稀释倍数	p24浓度 (LP/mL)	CV %
  HM上清液	1.223	86.687	12000	1.30E+10	/
  	3.143	291.899	2000	凌驾检测规模，无效
  PB核酸酶孵育	1.375	100.254	12000	1.50E+10	/
  	3.073	282.872	2000	凌驾检测规模，无效
  Centrifugation离心	1.073	73.79	12000	1.11E+10	/
  	3.019	275.974	2000	凌驾检测规模，无效
  CF-01澄清过滤	1.028	69.953	12000	1.05E+10	/
  	3.051	279.996	2000	凌驾检测规模，无效
  UF/DF浓缩换液	2.675	234.108	10000	凌驾检测规模，无效	/
  	0.653	39.453	60000	2.96E+10
  CF-02澄清过滤	2.484	212.127	10000	凌驾检测规模，无效	/
  	0.612	36.317	60000	2.72E+10
  GF凝胶过滤	2.048	165.17	10000	2.06E+10	5
  	0.522	29.342	60000	2.20E+10
  UF/DF-02浓缩换液	3.011	275.001	10000	凌驾检测规模，无效	/
  	1.021	69.346	60000	5.20E+10
  最终样	0.64	38.46	480000	2.31E+11	/
  	2.765	244.786	80000	凌驾检测规模，无效

  * 红色标记数据为凌驾检测规模数据

  在慢病毒纯化生产的工艺开发历程中，9个工艺历程的18个样品被收罗并举行滴度检测。实验效果发明：
  1. BET9登录网址慢病毒滴度p24检测试剂盒的稀释倍数低于用竞品的p24检测试剂盒的稀释倍数。
  2. 在稀释慢病毒到慢病毒滴度p24检测试剂盒的线性规模的历程中，18个样品使用BET9登录网址慢病毒滴度p24检测试剂盒一次稀释乐成率为 67%，而使用竞品p24检测试剂盒一次稀释乐成率为 56%。

常见问题解答

• 1. 物理滴度和熏染滴度有什么区别？

  病毒滴度有两种体现方法：以转导丈量的功效（熏染性）滴度或以病毒颗粒丈量的物理滴度。物理滴度是丈量样本中保存几多病毒，通常凭证卵白质（例如p24）的水平盘算。功效滴度是权衡有几多病毒可以熏染细胞的指标，通常比物理滴度低 100-1000 倍。

• 2. 测试中样本稀释液怎样选择？

  关于Lentivirus Titer p24 ELISA Kit (GenScript, L00938)，可以使用试剂盒中稀释后的1× Wash Solution举行样本稀释，效果是相同的。
  关于Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974)，在疏散游离p24阶段，可以差池慢病毒上清样本举行稀释；若稀释，则使用Cell culture medium（10% FBS）；在后续的ELISA检测阶段，可以使用试剂盒中稀释后的1× Wash Solution稀释。
  若是使用样本或制剂buffer作为标准品和样品的稀释液，需要通过预实验测试接纳率是否切合预期，切合预期则可以使用，不然不建议使用。其他稀释液例如超纯水，未添加FBS的DMEM等都不可包管正常输出效果。若是您需要验证方面的支持，可以联系BET9登录网址。
  关于Lentivirus Titer p24 Kit Easy (GenScript, L01019)，推荐使用 Assay Dilution Buffer（GenScript, B00062）。自行配制推荐配方为 1×PBS，10% FBS，1‰ Tween 20。

• 3. Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit，Lentivirus Titer p24 Kit Easy 有什么区别？

  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro 仅会检测出慢病毒衣壳中的p24卵白，不会检测出游离的p24卵白，通过ELISA要领测定，全程耗时约3 h。
  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit 检测的是总p24卵白，包括游离的p24卵白和慢病毒衣壳中的p24卵白，通过ELISA要领测定，全程耗时约2.5 h。
  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Easy 检测的是总p24卵白，通过化学放光法举行测定，孵育时间为15分钟，检测历程无需洗涤，全程耗时约30分钟。

• 4. BET9登录网址的慢病毒滴度p24试剂盒是否含有人源样本？

  均不含有人源质料，生物危害低。

• 5. 一个试剂盒可以检测几多个样本？

  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit (GenScript, L00938)，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974) 试剂盒中各配有一块预包被的96孔酶标板，其中包括8 孔 x 12 板条，我们建议凭听说明书中推荐的标准曲线稀释梯度，设置8个标准品事情液。 为了确保滴度的可靠定量，建议标准品和样品均一式两份举行重复测试。由此可盘算出一个试剂盒可以测试40个样本。
  Lentivirus Titer p24 Kit Easy (GenScript, L01019) 所提供的试剂可凭听说明书建议的事情体积举行96次测定。若是使用384孔板举行测定，所用试剂体积可举行等比例镌汰，但需要举行预实验确定测定的可靠性。

• 6. Lentivirus Titer p24 Kit Easy (GenScript, L01019) 需要特殊购置组份吗？

  本试剂盒中不提供检测微孔板以及剖析稀释液，客户可自行选购微孔板以及配制稀释液。
  BET9登录网址提供对应的产品：96-well Low Binding White Microplates & Sealers（GenScript, D00042）以及Assay Dilution Buffer（GenScript, B00062）。

• 7. Lentivirus Titer p24 Kit Easy (GenScript, L01019) 推荐使用何种检测板？差别检测板之间有什么区别？

  本品不牢靠检测板型号，客户可自行选择合适的检测板，以下为选择指南：
  

  • 建议优先使用不透光的白色多孔检测板检测发光信号。例如96-well Low Binding White Microplates & Sealers（GenScript, D00042）；
  • 不透光的玄色多孔检测板亦可用于本测试，信号相比于白色多孔检测板低，低约一个数目级，但不影响样品浓度的回算；
  • 底部透明但侧壁不透光的微孔板，若搭配本产品举行测试，需要在举行检测前，在微孔板底部贴一张白纸或白色封板膜以降低孔与孔之间光信号的交织滋扰；
  • 不推荐使用全透明微孔板，透明的侧壁会使相邻孔之间造成信号滋扰，影响输出准确值。

• 8. 测值凌驾线性规模是否有用？

  无效。需要调解稀释倍数重新复测。

• 9. 测试是否会泛起边沿效应？

  慢病毒滴度p24检测试剂盒均为25℃反应，不会泛起边沿效应。

• 10. 使用洗板机举行测准时需要更多的洗液，是否可以提供特另外洗液试剂？

  可单独选购 20× Wash Solution (GenScript, B00063)，该洗液适用于 Lentivirus Titer p24 ELISA Kit (GenScript, L00938)，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974) 。

• 11. 测定的读值办法需要使用什么样的仪器？

  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro, Lentivirus Titer p24 ELISA Kit 需使用能测定 450 nm 吸光度的酶标仪。酶标仪通过检测酶标板中液体的吸光值，读取OD值后举行定性或定量剖析。
  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Easy 需使用能举行化学发光检测的微孔板读数仪/读板机/酶标仪/剖析仪；Х⒐馄饰鲆峭ü獾绫对龉芙Х⒐夥从Γ复俜⒐饣蛑苯臃⒐猓┍⒌墓庑藕抛晃煊Φ男藕胖，用RLU（相对光单位）体现，以抵达定量或定性的检测目的。

参考文献

• Sena-Esteves M, Gao G. Titration of lentivirus vectors. CSH Protocols, 2018: 281-285.
• 国家药品监视治理局，体外基因修饰系统药学研究与评价手艺指导原则（试行）.2022.

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